Déterminer les EEE par leur ADN ?

 In dossiers de la lettre d'information

par Alain Dutartre et Nicolas Poulet

Le présent texte est une première contribution à un débat qui fera l’objet d’autres éléments d’un plus vaste dossier à constituer sur le sujet, tant les enjeux des investigations sur les espèces vivantes recourant à la génétique sont importants. Toutes les contributions sont les bienvenues (Merci de les adresser à Alain Dutartre : alain.dutartre@free.fr)

Le terme d’ADN est maintenant bien connu par le grand public par l’utilisation systématique qui en est faite dans toutes les séries policières diffusées par la télévision comme moyen d’identifier le coupable. Il est toutefois moins connu que l’identification par l’analyse de certaines parties de cette molécule de toutes les espèces vivantes non-humaines sur la planète est en cours depuis plusieurs années. A cette fin, des travaux systématiques sur l’identification de codes-barres génétiques ont débuté depuis une douzaine d’années. Ils se sont tout d’abord portés sur la faune puis sur la flore et, plus récemment, sur la détection d’espèces invasives. Ces résultats disponibles montrent le très grand intérêt de l’utilisation de cette technique dans la réalisation des inventaires de biodiversité mais il semble nécessaire que son intégration dans les démarches globales d’acquisitions d’informations environnementales destinées à la gestion des écosystèmes fasse l’objet d’une large réflexion rassemblant chercheurs et gestionnaires.

Codes-barres de l’ADN

Les inventaires des communautés vivantes sur la planète se sont organisés depuis plus de trois siècles à partir des travaux de Linné et l’utilisation de critères principalement morphologiques a permis une classification taxinomique, toujours utilisée, de tous les organismes végétaux et animaux répertoriés. Ces inventaires reposent sur l’observation directe des êtres vivants dans leur milieu ou en laboratoire à partir de prélèvements de terrain ce qui peut en compliquer la réalisation.

Depuis une douzaine d’années, à partir des travaux sur la génétique débutée en 1953, il est proposé de procéder à des détections de la présence des espèces par l’analyse de l’ADN contenu dans des fragments des organismes restant dans les eaux ou dans les sols. Confronté à une base de données de génomes des espèces, ces “restes” d’ADN appelés ADN environnemental peuvent ainsi, dans un certain nombre de cas, permettre de statuer sur la présence récente de telle ou telle espèce. Cette démarche est en particulier en cours de développement pour préciser la répartition en milieux aquatiques d’espèce exotiques envahissantes peu visibles (voir par exemple l’article  “ADN environnemental : un saut méthodologique pour les inventaires de la biodiversité” par Miaud, Taberlet, Dejean.  En juin 2013, un séminaire organisé à la Tour du Valat a présenté l’ADNe  – voir la présentation – . Le séminaire « Biodiversité aquatique : Quelles pistes pour la gestion des rivières et plans d’eau ? »  organisé par l’ONEMA en novembre 2012, a également traité du sujet).

Cette approche par “code-barres” (“barcoding“) de l’identification des espèces est assez récente, puisque la proposition d’y recourir a été faite dans un article de Hébert et ses collègues en 2003[1] intitulé “Identifications biologique par codes-barres de l’ADN”, dans lequel ils proposaient un nouveau système d’identification des espèces en utilisant une séquence de l’ADN d’une région normalisée du génome. Cette courte séquence pouvait être utilisée dans cette identification de la même manière que les codes-barres déjà utilisés dans les magasins. La proposition de départ concernait la faune et la séquence choisie n’était pas efficace pour identifier les plantes, aussi des travaux ultérieurs ont été menés pour déterminer deux régions de codes dans les chloroplastes des plantes.

Utilisant les quatre bases azotées de l’ADN (A, C, G, T), l’image d’une séquence de code-barres d’un passereau, le Pouillot boréal (Phylloscopus borealis), par exemple, est la suivante :

Code barre Pouillot boréal

Code barre du Pouillot boréal (source: http://ibol.org)

Lorsqu’une telle séquence de code-barres est obtenue et validée, elle est placée dans une bibliothèque répertoriant toutes les identifications réalisée de cette manière.

En à peine plus d’une décennie, les travaux dans ce domaine présentent une très importante progression puisque, par exemple, dans la base bibliographique du programme international de code-barres des êtres vivants (International Barcode of Life, iBOL[2]), 18 publications sur le sujet sont référencées en 2003 et 589 en 2012… Une douzaine de pays contribuent financièrement et scientifiquement à ce programme iBOL auquel ont participé près de 1000 chercheurs.

La bibliothèque des données d’identification basée sur l’ADN de ce programme (Barcode of Data Systems Life, BOLD[3]) rassemble les données moléculaires, morphologiques et de répartition des espèces. Selon les informations disponibles sur ce site, les espèces dont les codes-barres sont maintenant validés comportent près de près de 155 000 animaux, 59 000 plantes et de 17 000 champignons et autres espèces. Consultable à distance, cette bibliothèque fournit également de l’aide aux chercheurs engagés dans ces recherches.

GenBank[4] est une base de données de séquences génétique rassemblée dans le cadre d’une collaboration internationale comprenant des banques de donnés japonaise, européenne et américaine. Les données sont transmises au programme iBOL et peuvent être mises à disposition de chercheurs en faisant la demande.

Il s’agit donc d’une démarche toujours en cours, dont la complexité va nécessiter la poursuite de travaux à l’échelle mondiale pendant une durée difficile à estimer. Elle a tout d’abord concerné principalement la faune et si certains de ces codes-barres sont déjà validés, ce qui permet, entre autres choses de développer la démarche de recherche d’ADN environnemental (eADN) pour détecter la grenouille taureau ou le xénope lisse, les recherches continuent de s’approfondir sur le sujet. L’émergence progressive de codes-barres spécifiques pour certaines des familles d’organismes dont la détermination classique est difficile, par exemple pour des raisons de dimensions réduites et de morphologies proches, pourrait permettre d’améliorer les identifications et ainsi les caractérisations de l’écologie des différentes espèces concernées.

Exemple des travaux sur les lentilles d’eau

Les lentilles d’eau font partie des familles de plantes aquatiques pour lesquelles les déterminations ne sont pas toujours aussi faciles qu’il le paraît : les critères morphologiques et les photos disponibles ne suffisent pas toujours pour identifier l’espèce observée de manière certaine. Au moins deux espèces exotiques de lentilles sont considérées comme envahissantes en métropole : Lemna minuta (la lentille minuscule) et Lemna turionifera (la lentille d’eau rouge) et leur conformation ne permet pas toujours de les différencier des espèces indigènes avec lesquelles elles peuvent être fréquemment en mélange.

Leur grande dispersion dans les milieux d’eau douce du globe, leur facilité de récolte et de culture et les rôles qu’il est souvent envisagé qu’elles puissent jouer dans l’épuration des eaux, en font des espèces assez régulièrement étudiées. Parmi la littérature disponible sur les recherches menées sur leur “barcoding”, deux articles illustrent les travaux en cours et les difficultés qui subsistent.

Les travaux de Xu et al. (2015)[5] ont porté sur 220 clones de 4 espèces appartenant à 4 genres : Lemna aequinoctialis, Spirodela polyrhiza, Wolffia globosa et Landoltia punctata. Tous les prélèvements ont été effectués dans 18 districts de l’île chinoise de Hainan, île tropicale d’une superficie d’environ
34 000 km². Les analyses ont porté sur la séquence “ATPF-ATPH” et sur un autre marqueur moléculaire (rps16). Elles ont montré que ces deux marqueurs permettaient l’identification par code-barres des lentilles d’eau au niveau spécifique. Toutefois, les clones de la même espèce n’étaient pas tous distingués.

De même, les travaux de Wang et al. (2010)[6] ont porté des échantillons de lentilles d’eau provenant du monde entier : ils ont réuni 97 écotypes représentant les cinq genres de lentilles d’eau (Lemna, Landoltia, Spirodella, Wolffia et Wolffiella) et 31 espèces sur les 38 actuellement recensées sur la planète. 85 écotypes de 19 espèces leur ont effectivement servi dans les analyses statistiques et les propositions de séquence code-barres. Rappelant que la séquence de génome systématiquement utilisée comme code-barres pour la faune n’était pas efficace pour les plantes, ils ont testé plusieurs séquences proposées par un organisme international (Consortium for the Barcode of Life, CBOL[7]). Bien qu’ils précisent que ce marqueur n’avait pas permis de distinguer des paires étroitement liées d’espèces “sœurs”, telles que W. gladiata et W. oblonga ou L. minuta et
L. valdiviana, ils ont tout de même proposé comme code-barres d’identification universelle des espèces de lentilles d’eau une séquence utilisant les gênes “ATPF-ATPH”.

Les nombreux travaux de Landolt[8] sur les lentilles d’eau l’avaient amené à classer sur la base de la morphologie des frondes la famille des lentilles d’eau en 5 genres et 37 espèces. Dans la base de données en ligne des codes-barres ADN (http://www.boldsystems.org/) figurent actuellement 38 espèces.

Ci-dessous, à titre d’exemple, la représentation du code-barres de Lemna turionifera

Code barre Lemna turionifera

Code barre de Lemna turionifera (source : www.boldsystems.org)

Plantes invasives

Mais, de manière plus récente et plus large, et en complément des travaux sur toutes les espèces, de nombreuses investigations ont été spécifiquement lancées sur les espèces invasives : la grenouille taureau n’est donc plus une des rares cibles de cette approche moléculaire.

Par exemple, Van De Wiel et al. (2009)[9] ont montré qu’une séquence ADN “trnH-psbA” à elle seule constituait un marqueur efficace de différenciation de l’Hydrocotyle à feuilles de renouée (Hydrocotyle ranunculoides), espèce invasive en Europe, de plusieurs autres espèces du même genre morphologiquement très proches.

Dans le même objectif de tenter de différencier les espèces invasives d’espèces apparentées non invasives faisant l’objet d’échanges commerciaux sur une base autre que la morphologie, les travaux de Ghahramanzadeh et ses collègues[10] aux Pays-Bas ont porté sur 242 échantillons appartenant à 26 espèces de 10 genres de plantes aquatiques des familles Onagraceae (Ludwigia), Haloragaceae (Myriophyllum), Hydrocharitaceae (Lagarosiphon, Elodea, Egeria, Hydrilla) et Cabombaceae (Cabomba). Trois loci[11] potentiellement utilisables comme éléments de code-barre, “matK” “trnH-psbA”, et “rbcL” ont été testés. La première séquence, “matK”, n’a pas pu être amplifiée ou séquencée de manière fiable et a donc été exclue de l’analyse. Les deux autres ont permis de différencier huit espèces invasives de leurs espèces apparentées respectives et au final c’est la séquence “trnH-psbA” qui a donné les meilleurs résultats.

Scriver et ses collègues ont testé les mêmes trois séquences comme marqueurs spécifiques d’espèces invasives[12]. Ces chercheurs canadiens ont étudié dix espèces considérées comme invasives dans leur territoire, c’est-à-dire Myriophyllum aquaticum, Eichhornia crassipes, Cabomba caroliniana, Egeria densa, Salvinia molesta, Pistia stratiotes, Hydrocharis morsus-ranae, Stratiotes aloides et Trapa natans (notons que les trois dernières espèces de cette liste sont européennes mais que toutes les autres sont considérées comme invasives en Europe). Trente-sept échantillons de ces espèces obtenus dans différents points de vente de ces espèces ou prélevés dans la nature au sud de l’état d’Ontario durant l’été 2013 ont servi de base à ces travaux.

Selon ces travaux, le marqueur “matK” est apparu comme le plus susceptible de répondre aux objectifs poursuivis car il a permis d’identifier toutes les espèces sauf Trapa natans. En effet, le marqueur “rbcl” n’a pas donné de résultats utilisables et le marqueur “trnH-psbA” n’a pas donné les résultats escomptés. Les auteurs signalent que les différences de conclusions avec les travaux de Ghahremanzadeh et ses collègues sont probablement la conséquence du fait qu’ils n’ont pas utilisé les mêmes amorces d’amplification d’ADN.

Espèces invasives marines

Les milieux d’eau douce ne sont évidemment pas les seuls territoires aquatiques concernés par cette approche moléculaire.

C’est ainsi qu’en septembre 2012, 60 participants de 14 pays se sont réunis en Italie pour un atelier “MOLTOOLS” consacré à l’utilisation d’outils moléculaires pour le suivi et la compréhension des espèces marines envahissantes. Neuf publications issues de cet atelier viennent d’être publiées dans un numéro spécial de la revue Biological Invasions (volume 17, N° 3). Un éditorial en présente les principaux résultats[13].

Trois des articles de ce numéro portent sur des applications déjà largement adoptées des techniques moléculaires, c’est-à-dire une étude génétique du poisson Pempheris rhomboidea, un envahisseur “lessepsien”[14] de la mer Méditerranée, permettant de préciser l’identification de différentes populations et de reconstruire la phylogénie de l’espèce, une autre étude génétique sur la méduse invasive Mnemiopsis leidyi (voir à propos de cette espèce la lettre d’Information IBMA N°4, page 5) pour en préciser la phylogéographie, et une étude plus générale sur les méduses tente de préciser les dynamiques de leurs proliférations et d’identifier les lacunes subsistant dans la compréhension de ces phénomènes.

Deux autres articles présentent des réflexions plus générales, portant sur l’étude des mécanismes évolutifs, dont les modifications de l’environnement, pouvant influencer la génétique des populations invasives et expliquer leur succès, ce qui pourrait aider les gestionnaires à élaborer de meilleures prédictions des risques de propagations et des enjeux de ces invasions.

Les intérêts du séquençage à haut débit (HTS) permettant l’analyse génétique de communautés dans leur ensemble font l’objet de deux articles portant, l’un sur l’intérêt du “barcoding” dans différentes étapes des processus d’invasion, l’autre sur l’analyse des évolutions des communautés bactériennes en lien avec une prolifération de méduses.

La recherche de molécules naturelles issues des communautés vivantes, pouvant éventuellement servir dans la régulation des invasions biologiques comme mode de gestion alternatif, voire permettre l’obtention de médicaments ou d’autres éléments bioactifs commercialisables, est présentée dans un des articles comme un nouveau défi pour les chimistes (notons que cette approche fait également l’objet de travaux sur les espèces invasives terrestres ou des eaux douces).

Enfin, le dernier article de ce numéro spécial explore les relations complexes entre les chercheurs, et en particulier les généticiens, et les gestionnaires des invasions biologiques marines. L’auteur liste les principaux obstacles qui lui paraissent actuellement réduire les possibilités d’utiliser les informations issues des recherches génétiques dans les prises de décision : limitations ou malentendus concernant la résolution et de la sécurité offertes par les analyses génétiques, difficultés à mobiliser les décideurs dans la mise en œuvre de programmes de recherches et complexité des relations entre recherche fondamentale et gestion. Certains de ces obstacles sont donc inhérents aux analyses génétiques (limites théoriques et pratiques), d’autres sont en revanche l’illustration de défauts de communication et d’un engagement jugé insuffisant par l’auteur des utilisateurs potentiels des informations issues de la génétique.

Une nécessaire prise de distance

En quelques années, les coûts de ces analyses génétiques ont fortement baissés et leur mise en œuvre sur le terrain dans des conditions de routine est déjà possible, comme par exemple dans le cas des recherches d’espèces invasives (grenouille taureau, etc.). Elles pourront dans les années à venir s’appliquer sans aucun doute dans de multiples objectifs, concernant ou non les espèces invasives, et venir conforter dans certains cas l’acquisition de données de terrain, contribuant ainsi à l’amélioration de nos connaissances sur l’écologie des espèces.

Toutefois, leur mise en œuvre présente un certain nombre de limites inhérentes à la méthodologie utilisée et des risques vis-à-vis de la taxonomie “traditionnelle”, voire même, plus généralement, des investigations de terrain. Ces limites et ces risques ont été très rapidement mis en débat dans la communauté scientifique puisque dès 2005, Will et ses collègues[15] publiaient un article au titre clair “les périls de l’utilisation des codes-barres d’ADN et le besoin d’une taxonomie intégrative” (The Perils of DNA Barcoding and the Need for Integrative Taxonomy)“. Cet article reprenait dix questions abordées à l’occasion d’une conférence tenue en 2004 lors d’un débat entre K. W. Will et P. Hebert, le premier auteur de l’article proposant ces codes-barres, et les réponses apportées par les tenants de cette “taxonomie intégrative”.

Will et ses collègues soutenaient que l’utilisation systématique des codes-barres comme remplacement de la taxonomie traditionnelle pour nommer de nouvelles espèces et étudier leurs relations était “pire que mauvaise”, elle était “destructrice” (“worse than bad,… destructive“) en rappelant le risque de tout système unique. Leur proposition était de développer une taxonomie intégrative utilisant un grand nombre de critères, y compris l’ADN, pour identifier les taxons à tous les niveaux, y compris les espèces.

Parmi les questions (et les réponses apportées) figurait celle concernant les risques de disparition progressive de la taxonomie et des taxinomistes, une évolution déjà dénoncée depuis plusieurs années dans divers pays où le nombre de chercheurs impliqués dans cette discipline diminue rapidement.

En septembre 2014, une conférence intitulée “Quels botanistes pour le 21e siècle ? Métiers, enjeux, opportunités”[16] a réunit près de 300 participants à l’UNESCO à Paris. Inscrite dans la Décennie pour la biodiversité (2011-2020), elle avait pour objectif de bâtir une vision prospective du métier de botaniste au XXIe siècle. Espace de dialogue et d’échanges, elle devait contribuer à réaliser un état des lieux des problèmes et enjeux, à toutes les échelles, que la botanique peut aider à résoudre, analyser l’état de l’art et identifier les évolutions de cette discipline permettant de contribuer aux innovations scientifiques et technologiques pour les générations actuelles et futures.

Le point 16 de la déclaration finale déclare “ Reconnaitre également que, dans le but de répondre au besoin urgent d’accéder rapidement à des informations et des connaissances fiables et en libre accès sur la diversité des plantes et leurs utilisations, de nouveaux outils tels que les méthodes moléculaires (y compris les codes‐barres ADN), la télédétection et les technologies de l’information et de la communication (y compris les services internet) se sont avérés être un complément indispensable aux méthodes et disciplines de valeur bien établie, comme, entre autres, la taxonomie, l’anatomie, l’écologie, l’ethnobotanique, la phylogénie et la génétique.

Le développement d’une “taxonomie intégrative” reste évidemment au cœur des débats entre chercheurs et, par exemple, le “1er colloque R-Syst / Muséum national d’histoire naturelle” intitulé “Taxonomie Intégrative: De la génomique aux collections” est prévu à Versailles en octobre 2015[17]. R-Syst est un réseau national regroupant depuis 2012 une douzaine d’équipes de recherche de l’INRA impliquées dans la caractérisation moléculaire et morphologique d’organismes. Les travaux de ce réseau portent sur les virus, les bactéries, les champignons, les micro-algues, les plantes, les nématodes et les insectes

Ces débats ne sont sans doute pas près d’être clos, dans un contexte assez classique de querelle entre “anciens et modernes”, mais l’intégration progressive des diverses méthodes dites moléculaires dans l’outillage de base des investigations dans les milieux naturels devrait permettre de poursuivre l’acquisition d’informations indispensables à l’amélioration de nos capacités de gestionnaires.

Subsistent toutefois d’autres risques d’un recours systématique à ces techniques nouvelles sans prise de recul sur les objectifs recherchés. Ils pourraient avoir plus directement trait aux investigations de terrain, à l’acquisition de connaissances sur l’écologie des espèces et aux problématiques de gestion. C’est en particulier le fait que réaliser des campagnes de prélèvements sur le terrain uniquement pour déterminer les espèces présentes ne peut suffire à établir de diagnostics écologiques ni à évaluer l’état fonctionnel des milieux et encore moins à intégrer suffisamment d’informations pour en tirer des indications sur les enjeux de gestion de ces milieux.

Cette approche utilisant les progrès de la génétique nous sera sans nul doute d’une très grande aide dans nos travaux à venir mais nous devrons aussi rester vigilants pour que les futures investigations de terrain ne se résument pas, dans beaucoup de cas, à des prélèvements réalisés par des agents préleveurs formés à cette fin pour des analyses ultérieures de laboratoire.

Références

[1] Hebert P. D. N., Cywinska A., Ball S. L., deWaard J. R., 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci, 270 (1512), 313-321.

[2] http://ibol.org/

[3] http://www.boldsystems.org/

[4] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

[5] Xu Y., Ma S., Huang M., Peng M., Bog M., Sree K. S., Appenroth K. J., Zhang J. 2015. Species distribution, genetic diversity and barcoding in the duckweed family (Lemnaceae). Hydrobiologia, 743:75–87

[6] Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R., Messing J., 2010. DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots. BMC Plant Biology 10:205, 11 pp. (article en Open Access)

[7] http://www.barcodeoflife.org/ : ce consortium est une initiative internationale consacrée au développement des codes-barres d’ADN comme une norme mondiale pour l’identification des espèces.

[8] Landolt E., 1986. Biosystematic investigations in the family of duckweeds (Lemnaceae), Vol. 2: The family of Lemnaceae: a monographic study. – Morphology, karyology, ecology, geographic distribution, nomenclature, descriptions. Eidgenössische Technische Hochschule Zürich, Zürich.

[9] Van De Wiel, C.C.M., Van Der Schoot, J., Van Valkenburg, J.L.C.H., Duistermaat, H., Smulders, M.J., 2009. DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives. Mol. Ecol. Res. 9, 1086–1091.

[10] Ghahramanzadeh, R., Esselink, G., Kodde, L.P., Duistermaat, H., Van Valkenburg, J.L.C.H., Marashi, S.H., Smulders, M.J., van de Wiel, C.C., 2013. Efficient distinction of invasive aquatic plant species from non-invasive related species using DNA barcoding. Mol. Ecol. Res. 13, 21–31.

[11] un locus, pluriel loci, est un emplacement physique précis et invariable sur un chromosome, voir par exemple http://fr.wikipedia.org/wiki/Locus

[12] Scriver M., Marinich A., Wilson C., Freeland J.2015. Development of species-specific environmental DNA (eDNA) markers for invasive aquatic plants. Aquatic Botany 122, 27–31

[13] Darling J. A., Piraino S., 2015. MOLTOOLS: a workshop on “Molecular tools for monitoring marine invasive species”. Biol Invasions (2015) 17: 809–813

[14] Espèce ayant emprunté le canal de Suez créé par Ferdinand de Lesseps pour gagner la Méditerranée.

[15] WILL K. W., MISHLER B. D., WHEELER Q. D., 2005. The Perils of DNA Barcoding and the Need for Integrative Taxonomy. Syst. Biol. 54(5):844–851

[16] http://www.unesco.org/new/fr/natural-sciences/environment/ecological-sciences/man-and-biosphere-programme/events-2014/botanists-of-the-21-century/

[17] https://colloque.inra.fr/r-syst-2015

Cet article est également disponible en : Anglais

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